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多囊卵巢动物模型构建的探索

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  目的根据多囊卵巢形成的机制,建立一种新的多囊卵巢动物模型。方法给9日龄雌性未成年sd大鼠皮下注射丙酸睾丸酮(1.25mg/只),27日龄再连续9天注射绒毛膜促性腺激素(1.5iu/只)(作为lh的替代物);观察了卵巢形态、血清激素含量。结果 与空白组相比较模型组大鼠卵巢呈现多囊性改变,睾酮(t)升高,lh升高。结论 该模型与人多囊卵巢综合征典型改变相近似,其病理生理过程较为吻合,可用于多囊卵巢综合征实验研究。
  key words polycystic ovary animal model establishment 多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,pcos)是妇科常见的生殖功能障碍性疾病,主要表现为由于卵巢的雄激素过多所造成的闭经、多毛、肥胖及无排卵,其发生占生育年龄妇女的5%~10% .目前其发病原因临床尚无定论。建立多囊卵巢综合征动物模型对其病因的基础研究以及指导临床的诊断和治疗有深远的意义。本文提出一种新的pco动物研究模型建立方法,从形态、内分泌等方面进行了研究,以期能寻找一种理想的pco病理研究模型。
  1 材料与方法
  1.1 实验动物 选用孕18~21天的sd大鼠6只,选取所产幼崽24只,9日龄剔除雄性幼崽,21日龄断乳。均由湖南中医学院动物实验中心提供。给予颗粒饲料喂养,自由饮水。饲料由湖南中医学院动物实验中心提供。合格证编号:200310.
  1.2 试剂 丙酸睾丸酮(天津金耀氨基酸有限公司,生产批号:0304071);绒毛膜促性腺激素(hcg)(安徽新力药业公司马鞍山分厂公司生产,批号:030409);放免试剂盒(北京 北免东雅生物技术研究所提供)。
  1.3 动物模型的建立 按参考文献法 [2,3] 取出生后9日龄sd大鼠24只,分为模型组和正常对照组各12只,模型组大鼠9日龄颈背部皮下注射丙酸睾丸酮1.25mg/只,27日龄颈背部皮下注射hcg(1.5iu/只),每日2次,连续9天,正常对照组于同期颈背部皮下注射同体积生理盐水。两组分别于36日龄处死。
  1.4 取材
  1.4.1 血清学检查 处死前禁食水8h,称重,用25%的乌拉坦(3ml/kg))麻醉大鼠,颈动脉取血5ml,静置5min,3000r/min离心20min,4℃储存,按放免试剂盒说明书测血清中孕酮、雌二醇、睾酮、促卵泡生成素、促黄体生成素的含量。1.4.2 卵巢形态学观察 取出两侧卵巢组织,放入培养皿中,迅速剥离周围脂肪组织,用精密天平称重,放入10%甲醛中固定,送病理室作光镜检查。
  1.5 数据处理 实验资料为计量资料,以ˉx±s表示,组间差异的比较采用双侧t检验。
  2 实验结果
  2.1 大鼠体重及血清激素含量 见表1.表1 正常组与模型组体重及血清激素含量2.2 卵巢 卵巢大体解剖学改变:卵巢重量:实验组0.0528±0.0127g(n=24),显着高于对照组(0.0283±0.0047g),(p<0.01);对照组卵巢色泽红,实验组卵巢表面较苍白,体积增大,见较多囊状扩张的卵泡。
  2.3 光镜检查 正常组(图1,图2):低倍镜:可见多个黄体及不同发育阶段的卵泡,高倍镜下见卵母细胞发育正常,胞核与胞质比例适当,透明带完整,颗粒细胞呈多层(6~10层),形态完整,排列整齐,卵泡膜细胞呈梭形排列(2~3层)。模型对照组(图3、4):低倍镜:可见多个卵泡囊性扩张及卵泡闭锁,少量卵巢内有黄体组织,高倍镜下见闭锁卵泡内卵母细胞松散、肿胀、胞核固缩。颗粒细胞固缩、坏死,呈深染色团块状,并可见少量中性粒细胞,及见颗粒细胞层次减少,胞膜细胞增厚,卵泡腔内胞浆嗜碱性增强。
  3 讨论
  pcos的病理生理是一个复杂的问题,数十年来从不同途径和不同的对象进行逐步深入的探索,结果有相互补充的观点,也有许多争论的问题,已被公认的特征有:(1)雄激素过多;(2)高lh伴有正常或低水平的fsh;(3)恒定的雌激素水平;(4)卵巢组织形态学上有多个囊性卵泡和间质增生;(5)高胰岛素血症和胰岛素抵抗 [4] .目前病人大多依靠药物治疗,所以临床取材非常困难,这给病理生理机制的研究带来困难,所以许多学者都在寻找一种理想的病理研究模型来深入研究和探讨多囊卵巢综合征的发生、发展和治疗,多囊卵巢不仅在人,而且在许多种动物都可以发生,如牛、猫、豚鼠、大鼠等 [5] .由于大鼠有较稳定的动情周期,对实验研究来说较经济方便。人多囊卵巢的形成是由于卵巢基质过度刺激,高雄激素血症,大量闭锁卵泡引起。故早期研究的病理模型主要是大鼠注射外源性雄激素 [6] .亦有使用性激素制作病理模型者,但易自行恢复排卵。雄激素制作病理模型的不足之处是无pcos表现的卵巢白膜增厚及体积增大,相反其体积和重量只有正常的二分之一,在激素改变方面,血中lh不增加反而减少,对fsh和卵巢楔形切除术不敏感。与人pcos有很大差别。而其特点是雄激素升高、持续不排卵,并还可导致高胰岛素血症和胰岛素抵抗。由此我们考虑是否可在此基础上根据多囊卵巢综合征除已被公认的特征雄激素过多,还有高lh伴有正常或低水平的fsh、lh/fsh比值倒置,使用雄激素联合绒毛膜促性腺激素(hcg)(作为lh的替代物)制作大鼠多囊卵巢综合征病理模型。因为lh已被证实在排卵前高峰时,促进 颗粒细胞的分化,同时还抑制颗粒细胞的有丝分裂,从而限制了颗粒细胞的数量,最终导致卵泡发育停止。多数无排卵pcos病人中lh是增加的,但没达到其排卵前高峰期水平,此外,胰岛素(ins)与lh也有相关。有实验证实 [7] ,当对小鼠单独应用hcg(作为lh的替代物),卵巢的大小有轻度的增加,并出现小囊,将ins与hcg联合应用时,卵巢明显增大,并出现多个小囊,与pcos有相同的卵巢形态变化,阴道涂片检查这些小鼠无排卵。经培养卵泡膜细胞观察ins对雄激素(a和t)生成的影响,ins可增加t和a的基础分泌分别达2倍和3倍,如还有lh存在则t可增加3倍,a可增加6倍。可能lh与ins协调作用促使雄激素生成增加,卵巢增生形成多囊的改变。我们假设ins使lh作用放大,从而进一步增加体内已增加的lh对颗粒细胞的作用,这样lh对正在成熟过程中卵泡的影响相当于在正常周期中仅在lh高峰时所发挥的作用,使颗粒细胞过早进入分化状态,从而导致卵泡的颗粒细胞增殖终止,因此不能发生排卵。我们进行的实验结果表明:使用雄激素联合hcg可造成大鼠卵巢呈现多囊性改变,睾酮(t)升高,lh升高,与人多囊卵巢综合征典型改变相近似,其病理生理过程较为吻合。故笔者认为本病理模型用于多囊卵巢综合征实验研究较为理想。
 

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邸红香 沈阳凤凰妇科医院院长

专家简介:原任沈阳奉天医院妇产科主任,从事妇产科工作近四十年,曾于日本札幌市立病院学习工作多年...详细内容...【详细】

擅长:妇科肿瘤摘除术,子宫腺肌症、子宫肌瘤、卵巢肿瘤、子宫内膜异位症、宫颈癌、子宫体癌等微创手术等方面有着丰富的临床经验和独到的诊疗见解。

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